Анализ на малярию

Содержание

Малярия

Малярия – это инфекционное заболевание, которое вызывает повторяющиеся приступы озноба и лихорадки. Возбудителем малярии является плазмодий – паразит, передающийся с укусами комаров – носителей инфекции. Каждый год от малярии умирает примерно один миллион людей по всему миру, но наиболее распространена она в странах с тропическим и субтропическим климатом.

Вакцины для предотвращения малярии не существует, однако при приеме профилактических средств риск заболеть снижается.

Успешность лечения зависит от вида плазмодия, состояния больного и других факторов.

Синонимы русские

Болотная лихорадка, перемежающаяся лихорадка, пароксизмальная малярия.

Синонимы английские

Malaria, Jungle fever, Marsh fever.

Симптомы

Для малярии характерно периодическое повторение приступов (каждые 48-72 часа, в зависимости от вида возбудителя). Приступ длится примерно 1-2 часа и сопровождается следующими симптомами:

  • озноб – от умеренного до тяжелого,
  • высокая температура тела (до 39-41 °С),
  • кашель,
  • обильное потоотделение (появляется в конце приступа и сопровождается снижением температуры до нормальной или ниже нормы).

Кроме того, могут появляться другие симптомы:

  • головная боль,
  • тошнота, рвота, понос,
  • усталость, быстрая утомляемость,
  • потеря аппетита,
  • боль в мышцах,
  • желтуха.

Как правило, малярия проявляется в течение нескольких недель после укуса зараженного комара. Однако некоторые паразиты могут находиться в организме несколько месяцев или лет, не вызывая никаких симптомов.

Общая информация о заболевании

Малярия – это инфекционное заболевание, которое вызывает повторяющиеся приступы озноба и лихорадки. Возбудителем являются четыре вида паразитов, передающихся с укусами комаров – носителей инфекции. Реже малярия распространяется через переливание крови или от матери к плоду. Чаще всего она встречается в странах с тропическим и субтропическим климатом.

Жизненный цикл малярийного паразита начинается, когда самка комара вида анофелес, питаясь кровью больного малярией, проглатывает паразитов. В процессе полового развития в организме комара из них развиваются спорозоиты (одна из жизненных форм паразита), располагающиеся в слюнных железах насекомого.

При укусе комар вводит слюну со спорозоитами в организм человека, где они размножаются бесполым путем в клетках печени. После периода созревания, длящегося от нескольких суток до нескольких месяцев, паразиты высвобождаются из клеток печени и проникают в эритроциты (красные кровяные тельца), что является началом активной фазы болезни. В эритроцитах происходит дальнейшее бесполое размножение паразитов; при разрыве оболочки эритроцита (каждые 48-72 часа) плазмодии оказываются в плазме крови, что обуславливает возникновение лихорадки и озноба. Затем они проникают в непораженные эритроциты и цикл повторяется. Промежуточные формы плазмодий способны сохраняться в организме (в печени) до нескольких лет, вызывая повторное развитие заболевания даже после курса лечения.

Малярия может привести к смерти, чаще всего от нее умирают дети в возрасте до 5 лет. Обычно летальный исход связан с осложнениями заболевания:

  • церебральная малярия – зараженные эритроциты могут закупоривать мелкие кровеносные сосуды мозга, вызывая его отек или повреждение;
  • дыхательная недостаточность из-за накопления в легких жидкости;
  • повреждение органов – печеночная или почечная недостаточность, повреждение селезенки;
  • тяжелая анемия как следствие уменьшения количества нормально функционирующих эритроцитов;
  • низкий уровень сахара в крови (может быть спровоцирован как малярией, так и ее лечением).

Кто в группе риска?

Чаще всего малярией болеют люди, живущие в странах с тропическим и субтропическим климатом (африканские государства к югу от пустыни Сахары, индийский субконтинент, Соломоновы острова, Папуа-Новая Гвинея и Гаити), или гости этих стран.

Более тяжелому течению малярии подвержены:

  • дети до 5 лет,
  • туристы из регионов, где не распространено данное заболевание, посетившие субтропические или тропические страны,
  • беременные и их еще не рождённые дети,
  • бедные слои населения, не имеющие доступа к квалифицированной медицинской помощи.

Диагностика

Заподозрить заболевание позволяют периодические приступы лихорадки, особенно если пациент находился в очагах малярии за последние два года. Для подтверждения диагноза необходимо обнаружить паразита в мазках крови.

Лабораторные методы исследования

  • Микроскопия мазка крови. Этот анализ до сих пор остается ведущим методом диагностики малярии. Он достаточно простой и недорогой, однако относительно трудоемкий. Кровь для приготовления мазка необходимо брать у пациента во время приступа лихорадки – это повышает вероятность обнаружения малярийных плазмодиев. После изготовления мазка и его окраски по специальной технологии можно обнаружить самих возбудителей заболевания или характерные изменения эритроцитов. В частности, при малярии в эритроцитах определяются пятна, обусловленные включениями плазмодиев. По результатам исследования мазка крови судят о наличии инфекции, а также определяют вид паразита и стадию заболевания.
  • Определение антител к возбудителю малярии – молекул, вырабатываемых иммунной системой в ответ на попадание в организм малярийного плазмодия. Отрицательный результат анализа позволяет исключить диагноз «малярия».
  • Определение белков возбудителя. Современный анализ, с помощью которого можно выявить в крови молекулы, входящие в состав малярийного плазмодия. Это быстрый, недорогой метод диагностики, обладающий высокой достоверностью в отношении малярийной инфекции.
  • Определение генетического материала малярийного плазмодия методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Позволяет определить даже незначительное число возбудителей заболевания в крови. В силу высокой стоимости исследование широко не распространено.
  • Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ).
    • Гемоглобин и эритроциты. Так как при приступах малярии происходит разрушение эритроцитов (гемолиз), их уровень в крови, а также уровень содержащегося в них гемоглобина может быть снижен, свидетельствуя о развитии анемии.
    • Тромбоциты. Снижение уровня тромбоцитов является характерным признаком малярии и наблюдается примерно у 70 % больных.
    • Лимфоциты. При малярии в крови могут определяться измененные (атипичные)лимфоциты (белые кровяные тельца).
    • Ретикулоциты – это созревающие эритроциты. Так как при приступах малярии зрелые эритроциты разрушаются, выработка ретикулоцитов возрастает.
  • Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – фермент, который содержится во многих органах и тканях человека, в том числе в эритроцитах. Повышение ЛДГ является характерным признаком малярии.
  • Аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ). Повышение уровня печеночных ферментов АЛТ и АСТ будет указывать на повреждение печени, вызванное малярией.
  • Общий билирубин. Билирубин – конечный продукт распада гемоглобина. При усиленном разрушении эритроцитов его уровень повышается.

Другие методы исследования

  • Компьютерная томография головного мозга. При признаках поражения центральной нервной системы может потребоваться выполнение компьютерной томографии головного мозга, которая позволяет выявить отек головного мозга и кровотечение в его оболочке.

Лечение

Лечение малярии предполагает прием специальных противомалярийных препаратов, а также устранение осложнений заболевания.

Отмечается устойчивость некоторых видов малярии к лекарствам. Вакцины, позволяющей полностью избавить пациента от этого заболевания, не существует, хотя ее поиски активно ведутся.

Профилактика

  • Применение противомалярийных препаратов при путешествиях в регионы с высоким уровнем заболеваемости малярией.
  • Предотвращение заражения через укус. Избежать укусов комаров можно с помощью:
    • обработки стен дома специальными спреями,
    • использования москитной сетки, пропитанной препаратами против комаров,
    • ношения одежды, закрывающей тело, опрыскивания одежды противомоскитными спреями.

Рекомендуемые анализы

  • Общий анализ крови
  • Лактатдегидрогеназа
  • Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
  • Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
  • Общий билирубин

МУК 3.2.987-00 Паразитологическая диагностика малярии

МУК 3.2.987-00

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Паразитологическая диагностика малярии

Дата введения 2001-01-01

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 19 октября 2000 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Область применения и нормативные ссылки

1. Область применения и нормативные ссылки

Паразитологическую лабораторную диагностику малярии проводят клинико-диагностические лаборатории лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) системы Минздрава, ведомственных учреждений, а также другие лаборатории, независимо от принадлежности и форм собственности (НИИ, вузов, Минобороны, УВД, частных клиник и т.д.), имеющие лицензию и аккредитованные в системе госстандарта и госсанэпиднадзора в установленном порядке.
Органы и учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации организуют и проводят эпидемиологический надзор за малярией, частью которого является:
контроль за уровнем лабораторной диагностики малярии в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и других ведомств (в т.ч. исследования: 1) контрольные — не менее 10% препаратов крови, от числа отрицательных; 2) обязательные — 100% сомнительных и положительных препаратов крови с целью подтверждения лабораторного диагноза малярии);
обследование населения в очагах малярии, обследование населения по эпидпоказаниям и с консультативной целью.
В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативно-методические и правовые документы.
Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (30 марта 1999, N 52-ФЗ).
«Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» (22 июля 1993, N 5487-1).
Санитарные правила и нормы 3.2.569-96* «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации».
_______________
* Действуют СанПиН 3.2.1333-03. — Примечание изготовителя базы данных.
Санитарные правила 3.1/3.2.558-96* «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний».
_______________
* Действуют СП 3.1/3.2.1379-03. — Примечание изготовителя базы данных.
Санитарные правила 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности и гельминтами».

2. Общие положения

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных и местных случаев заболевания требуют своевременной лабораторной диагностики, необходимой для адекватного лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.
Малярию человека вызывают 4 вида паразитических простейших рода Plasmodium: Р. falciparum — возбудитель тропической малярии, Р. vivax — трехдневной малярии, Р. ovale — малярии типа трехдневной, Р. malariae — четырехдневной малярии. Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера: географический анамнез (пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера: лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки и ряд других — обязывают врачей лечебно-профилактических учреждений заподозрить малярию.
Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

3. Характеристика развития малярийного паразита в эритроцитах

Проявления малярии обусловлены развитием паразита в эритроците — так называемой эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии образуются бесполые и половые формы паразита.
Бесполые формы за период времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития, строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные свойства) хорошо различимы в «тонком мазке» крови. Трофозоиты — одноядерные растущие стадии: кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые. Шизонты — делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые), с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые, представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с обособленными ядрами и цитоплазмой. В динамике эритроцитарная шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит, внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется — кольцевидный трофозоит. На этой стадии цитоплазма имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки. По мере роста паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся по форме и числу, псевдоподии — образуется амебовидный трофозоит. В дальнейшем у развивающегося трофозоита постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и количество цитоплазмы — образуется зрелый трофозоит. Зрелый трофозоит — округлая или несколько вытянутая клетка с относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита. Затем наступает стадия шизонта, начинается попарное деление ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь вокруг каждого из дочерних ядер — образуется зрелый шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для каждого вида плазмодиев (см. таблицы). При отсутствии или неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты, и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев продолжительностью развития одной генерации. У Р. falciparum, P. vivax, P. ovale — 48 ч, Р. malariae — 72 ч.
В процессе роста паразита в его цитоплазме появляется малярийный пигмент — продукт метаболизма гемоглобина, представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от золотисто-коричневого до черного цвета. Количество пигмента, размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются по мере его перехода в последовательные стадии развития.
У части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются в половые формы, гаметоциты — женские (макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты). Мужские и женские гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли, характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом. Округлая форма присуща гаметоцитам Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) — Р. falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем бесполых форм. При этом женских гаметоцитов в 3-5 раз больше, чем мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты Р. vivax, Р. ovale, P. malariae значительно отличаются от гаметоцитов Р. falciparum по срокам созревания, появления в периферической крови и сохранения способности заражать переносчика (самок комара Р. anopheles).

Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae развиваются в эритроцитах, циркулирующих в периферической крови. Развитие Р. falciparum происходит в синусах селезенки и мелких капиллярах внутренних органов в связи с адгезией пораженных эритроцитов к стенкам таких капилляров. В периферической крови обнаруживаются, преимущественно при неосложненном течении, только самые молодые стадии — кольцевидные трофозоиты. Их число очень быстро нарастает, поэтому при однократном исследовании периферической крови в начале болезни можно получить неправильное представление об истинном числе паразитов. При осложненном течении в периферической крови могут быть обнаружены более зрелые возрастные стадии паразита и гаметоциты в связи с нарушением сосудистого тонуса.
При оценке результатов исследования препаратов крови, наряду с типичной морфологией возбудителя, необходимо учитывать ряд особенностей, характеризующих паразитологическое развитие инфекции собственно и привходящих воздействий (предшествовавшее применение противомалярийных препаратов, неправильное приготовление и окраска препаратов крови).

4. Принцип метода паразитологической диагностики малярии

Паразитологическая диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно только в период его развития в эритроците. Для обнаружения плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом «тонкого мазка» и «толстой капли», окрашенные по Романовскому-Гимза. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.
Основной метод — «толстая капля». Благодаря распределению относительно большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30-40 раз большее, чем в «тонком мазке», что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии. Начинать надо всегда с просмотра «толстой капли».
Чувствительность метода «толстой капли» такова, что при просмотре 100-150 полей зрения можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови. Концентрация исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы, «толстую каплю» окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации. Несмотря на определенную специфичность, такая деформация иногда может препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром «толстой капли» можно только, если вид паразита был первоначально установлен. «Толстая капля» относительно быстро позволяет выявить и других паразитов крови: трипаносом, микрофилярий, спирохет, бабезий и др. Отрицательный паразитологический результат изучения «толстой капли», но повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов позволяет предположить перенесенную недавно малярию (при отсутствии соответствующих анамнестических данных), обнаружение повышенного содержания лейкоцитов, их видовой состав, а также повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов, позволяют предположить иное заболевание, не связанное с малярией.
В «тонком мазке», фиксированном до окраски, сохраняются морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и присущие данному виду паразита. Большое значение для дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных эритроцитов. «Тонкий мазок» крови делают в дополнение к «толстой капле». В тех случаях, когда вид возбудителя в очаге установлен, для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом «толстой капли».

5. Необходимые реактивы и оборудование

1. Этиловый спирт 96°.

2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска).

3. Метиленовый синий.

4. Этиловый эфир.

5. Глицерин.

6. Тетраборат натрия (бура).

7. Калий фосфат однозамещенный безводный — KHPO.

8. Натрий фосфат двузамещенный безводный — NaHPO.

9. Смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в равных частях).

10. Дистиллированная вода.

11. Индикаторная бумага (диапазон рН 5,0-8,0).

12. Фильтровальная бумага.

13. Химическая посуда: мерные цилиндры или стаканы на 10, 50 и 100 мл; градуированные центрифужные пробирки; колбы и стаканы; стеклянные палочки.

14. Предметные стекла

15. Шлифованные стекла.

16. Фарфоровая ступка с пестиком.

17. Аптечные равноплечие или электронные весы.

18. Эмалированные кюветы.

19. Пинцеты.

20. Часы песочные или сигнальные.

21. Стеклянные мостики или специальные контейнеры для окрашивания препаратов крови.

22. Скарификаторы стерильные одноразовые.

23. Бинты стерильные, вата.

24. Перчатки резиновые.

25. Микроскоп с осветителем (объективом х90 или х100, окуляром х7; х10).

26. Термостат.

27. Холодильник.

6. Техника паразитологической диагностики

6.1. Подготовка предметных стекол

1. Предметные стекла новые замачивают в мыльном растворе, нагревают до 60-80 °С, но не кипятят.

2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной воде в течение 2-3 ч, периодически перемешивая.

4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин.

5. Проверяется качество отмывки предметных стекол от щелочи: на предметное стекло наносят 1 каплю фенолфталеина — появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6. Стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло), где они могут храниться в течение длительного времени.

7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной стираной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую (!) бумагу небольшими партиями и стерилизуют.
Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать не рекомендуется. При необходимости их использования, следует удалить следы иммерсионного масла простиранной ветошью, затем отмыть каждое стекло от окрашенных препаратов крови в теплом мыльном растворе (для этой цели удобно использовать зубную щетку с коротко срезанной щетиной). Дальнейшая обработка — такая же, как и новых стекол.

Во время манипуляций с чистыми предметными стеклами их следует брать только за боковые поверхности или пинцетом.

6.2. Приготовление и хранение реактивов

6.2.1. Раствор краски Романовского-Гимза

Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленный или приготовленный из сухой субстанции) представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить длительное время в хорошо закупоренных бутылях из темного стекла в сухом защищенном от света прохладном месте (но не в холодильнике). Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимза необходимое количество маточного раствора краски, отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя, т.к. при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Краску следует набирать сухой пипеткой или отливать через горлышко. Для определения качества краски рабочим раствором каждой новой серии производят пробное окрашивание мазков крови.
Для приготовления маточного раствора из сухой краски Романовского-Гимза необходимы следующие реактивы:
азур-эозин — 10 г;
глицерин — 100 мл;
спирт этиловый 96° — 900 мл.
Техника приготовления краски предусматривает следующие этапы:

1. Азур-эозин тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством спирта и глицерина до получения кашицеобразной массы и сливают в колбу или бутыль из темного стекла. Затем постепенно добавляют остальной спирт и глицерин.

2. Полученную взвесь тщательно встряхивают в течение 10 мин 2-3 раза.

3. Емкость с краской помещают в термостат при температуре 37° на 3-5 дней для созревания краски с ежедневным встряхиванием этой емкости вручную не менее 10 мин. При наличии магнитной мешалки встряхивание можно продолжать несколько часов. При наличии подогревателя в мешалке взвесь можно подогревать, при этом подогрев не должен превышать 40-50°, периодически подогреватель следует выключать с тем, чтобы температура не повышалась выше указанного уровня. Встряхивание и подогрев улучшают качество краски.
После каждого встряхивания раствор снова помещают в термостат.

4. Через 3-5 дней готовый раствор краски фильтруют через бумажный фильтр.

6.2.2. Буферный раствор

Необходимые реактивы:

1. Дистиллированная вода — 1 л.

2. Фосфат калия однозамещенный безводный — KHPO — 0,27 г.

3. Фосфат натрия двузамещенный безводный — NaHPO — 0,67 г.
Техника приготовления:

1. Соли растворить в дистиллированной воде (1/3 объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1000 мл и размешать.

2. Приготовленный раствор должен иметь рН 7,0±0,2. Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если рН<6,8, то следует добавить NaHPO, если рН>7,2, то добавляется KHPO. Количество реактивов, необходимых для доведения рН, подбирается опытным путем.
Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Для приготовления краски используется буферный раствор комнатной температуры. Нельзя использовать буферный раствор с осадком, который после окраски затрудняет просмотр препарата и даже может привести к диагностическим ошибкам. Периодически следует проверять рН буферного раствора, особенно при искажении цвета окрашенных элементов крови.

6.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

1. Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых — обычно безымянного, у детей — из большого), у новорожденных детей — из большого пальца ноги (но не мочки уха).

2. Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений.

3. Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы.

4. В целях безопасности пациента взятие крови на малярию производят на стерильные предметные стекла, т.к. во время взятия крови возможно их касание к месту прокола.

5. Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70%-ном спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии.

6. Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы избежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу.

7. Последующие капли (выступающие самостоятельно или при надавливании на палец массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. При этом кровь забирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла. Если кровь набирают в капилляр, то можно использовать не стерильные стекла, но подготовленные так же, как описано в п.6.1.

8. От одного пациента готовят не менее 2-3 стекол с «толстыми каплями» и 2-3 «тонких мазка» крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, с тем чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.

При косвенных показаниях (анамнестических, эпидемиологических, клинических) о наличии малярии у обследуемого, но отрицательном первичном результате, кровь исследуют повторно через каждые 6-12 часов в течение 2-х суток.

6.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

6.4.1. Препарат «толстая капля»

1. Препарат «толстая капля» на предметном стекле без мазка (рис.1):
на предметное стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют в равномерный диск или прямоугольник размером 1-1,5 см.
на краю стекла делается мазок в виде полоски крови для маркировки препарата, при массовых обследованиях делаются две полоски, где наносят маркировку.

Рис.1. «Толстые капли» на предметном стекле без мазка

Рис.1. «Толстые капли» на предметном стекле без мазка

2. Препарат «толстая капля» на мазке (рис.2):
на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый для исследования на малярию;
сразу после приготовления мазка, пока мазок не высох, его влажной поверхностью прикасаются к выступившей капле крови или наносят кровь из капилляра;
кровь на влажном мазке распределится в равномерный диск при осторожных наклонах предметного стекла под небольшим углом в разные стороны; чем больше взятая капля крови, тем больше площадь, по которой она распределится.

Рис.2. «Толстые капли» на мазке

Рис.2. «Толстые капли» на мазке

Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло. Толщина «толстой капли» должна быть такой, чтобы через нее просматривался печатный текст. Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат непригоден для исследования.
Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в «толстой капле» является обнаружение в 1 поле зрения микроскопа в среднем 10-15 лейкоцитов (увеличение: объектив х90-100, окуляр х7).

3. Комбинированные препараты (рис.3).

Рис.3. Комбинированное приготовление препаратов крови

Рис.3. Комбинированное приготовление препаратов крови

В целях экономии стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят «тонкий мазок» и «толстую каплю».
Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходима четкая последовательность их обработки. Необходимо начинать с окраски «толстой капли» погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют «тонкий мазок» и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации «тонкого мазка», т.к. даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен «тонкий мазок», в «толстой капле» эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной.
Все препараты высушивают на воздухе. Для ускорения высыхания «толстых капель» можно использовать обычный комнатный вентилятор.

Высушивание на солнце, огне или любом другом источнике тепла исключается, так как препарат становится непригодным для исследования.

Особенно это относится к «толстой капле», которая под действием тепла подвергается аутофиксации и необходимый гемолиз при окраске не наступает. «Толстые капли» (особенно в процессе высыхания) и фиксированные «тонкие мазки» следует беречь от тараканов, мух и муравьев, съедающих кровь.

6.4.2. Препарат «тонкий мазок » (рис.4)

Рис.4. «Тонкий мазок» крови

Рис.4. «Тонкий мазок» крови

2. Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа*.

3. Двумя пальцами левой* руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе.

4. Край шлифованного стекла (фиксированного в правой* руке) ставится под углом 45° к предметному стеклу, прикасаясь к левому* краю капли крови.

5. После того как капля растекается по касательной линии в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево* к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить «тонкий мазок» бахромчатой частью, где наиболее четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить до конца и краев предметного стекла, заканчиваться бахромчатым краем (рис.4).
________________
* Для лаборанта левши читать вместо левого положения — правое, вместо правого — левое.
Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это маскирует некоторых паразитов, а также приводит к их деформации); если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка. Качество «тонкого мазка» зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла.
На плохо вымытом жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла «тонкий мазок» получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис.5.

Рис.5. Дефекты приготовления «тонких мазков»

Рис.5. Дефекты приготовления «тонких мазков»

6.4.3. Маркировка препаратов крови

1. Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания).

2. Маркировка включает фамилию и инициалы или номер истории болезни (можно номер страхового полиса), или порядковый номер по списку обследуемого и, обязательно, дату взятия крови.

3. Препарат «толстая капля», приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4. Препарат «толстая капля» на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.
5. «Тонкий мазок» маркируют в толстой части (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

6.4.4. Фиксация «тонких мазков»

1. Фиксацию мазков проводят: в этиловом спирте 96% — 10 мин или в смеси Никифорова — 20 мин.

2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.
Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

Препарат «толстая капля» не фиксируют!

При длительном хранении (особенно в жарком климате) неокрашенных «толстых капель» может произойти их аутофиксация. При необходимости хранения «толстых капель» для предотвращения аутофиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г NaHPO + 1 г KHPO + 300 мл дистиллированной воды). «Толстую каплю» после высыхания погружают в этот раствор на 1 секунду, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием окрашивают по Романовскому меньше, чем обычное время — в течение 6-10 минут.

6.5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови.

6.5.1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского-Гимза

Для окрашивания препаратов крови используется 5% или 10% водный рабочий раствор краски Романовского-Гимза.

1. Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленного изготовления или приготовленный из сухой краски) перемешать и обязательно профильтровать.

3. Готовый рабочий раствор перемешать.

4. При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20%-ный раствор, сократив время окраски до 15-20 мин.

Рабочий раствор для окраски препаратов крови использовать только свежеприготовленный!

Качество каждой новой серии краски необходимо оценить. С этой целью производят пробную окраску препаратов «тонкого мазка» и «толстой капли» крови от здорового человека (если нет крови с малярийными паразитами). Концентрацию рабочего раствора и время окрашивания можно подобрать самостоятельно, т.к. они зависят от качества исходного раствора краски и от температуры окружающей среды.
Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроскопии:
ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с различимой структурой;
зернистость базофилов фиолетового цвета;
зернистость эозинофилов красного цвета;
у моноцитов на фоне серо-голубой цитоплазмы может быть розовая зернистость;
зрелые эритроциты — розового цвета с сероватым оттенком;
ретикулоциты — сиренево-голубые;
тромбоциты — сиренево-розового цвета с различимой сетчатостью.
Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского недостаточно азура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов и лейкоцитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мансона, которую готовят впрок следующим образом: 1,5 г метиленового синего и 2,5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10-12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40-60 мин при 60-80°.

Раствор не кипятить!

Синька Мансона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мансона, добавляемое к рабочему раствору краски Романовского, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

6.5.2. Способы окрашивания и промывки «тонкого мазка» и «толстой капли » по Романовскому-Гимза

Окрашивание препаратов крови можно проводить двумя способами.

Лабораторные методы диагностики малярии

Диагностика малярии основана на данных клинических проявлений, эпидемиологического расследования и лабораторных методах исследования, включающих методики выявления паразитов, их количества, видовую принадлежность и обнаружение антител в организме исследуемого. Обследованию в первую очередь подлежат пациенты из группы риска — прибывшие из эндемичных по малярии регионов, лихорадка у которых появилась в первые два года после выезда из этих регионов.

Рис. 1. Забор крови для приготовления препарата «толстая капля».

Рис. 2. Окраска и вид препаратов «толстая капля» и тонкий мазок.

Диагностика малярии с использованием микроскопического метода

Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка, позволяющая обнаружить паразитов, их количество и видовую принадлежность, является ведущим методом диагностики малярии. Она проводится при малейшем подозрении на это заболевание, независимо от температурной реакции пациента. Для определения видовой принадлежности паразитов и стадии заболевания используется тонкий мазок крови. В толстой капле локализуется больше паразитов, чем в мазке. Этот метод диагностики превосходит методику определения наличия возбудителей малярии в тонком мазке крови в 20 — 40 раз.

В периферической крови паразиты обнаруживаются через определенное время после заражения:

  • при 3-х дневной малярии — через 8 — 12 дней,
  • при тропической — от пяти с половиной дней до 12,
  • при 4-х дневной — через 15 — 21 день,
  • при малярии, подобной 3-х дневной — через 9 — 15 дней.

Паразиты в крови присутствуют как во время лихорадочного приступа, так и в межприступный период и при паразитоносительстве.

Рис. 3. Техника приготовления тонкого мазка.

Техника приготовления «толстой» капли

Полученная при проколе пальца капля крови наносится на предварительно очищенное и сухое предметное стекло и размазывается до получения пятна 1 см в диаметре. После подсушивания на воздухе предметное стекло заливается краской Романовского—Гимзы. По истечении 40-минутной экспозиции препарат ополаскивается под проточной водой и подсушивается при комнатной температуре, установленный в вертикальное положение.

Под микроскопом исследуется не менее 100 полей зрения. Более эффективным считается исследование 2-х толстых капель в течение 2,5 минут, чем 1-й капли в течение 5-и минут. 100 полей зрения просматриваются даже в том случае, когда малярийные плазмодии выявились уже в первых полях. Это производится для того, чтобы не пропустить микст-инфекцию.

Рис. 4. Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка является ведущим методом диагностики малярии.

Порог обнаружения паразитов

Порогом обнаружения малярийных плазмодиев называется минимальная концентрация возбудителей, которую возможно выявить при микроскопировании препарата «толстая капля». При заболевании этот показатель составляет 5 паразитов в одном микролитре крови. При просмотре 100 полей зрения обследуется 0,2 мкл крови.

При наличии косвенных признаков малярии (пребывание в эндемичных зонах, гипохромная анемия, обнаружение пигмента в моноцитах) и отрицательных результатов исследования препаратов «толстая капля», исследование вновь повторяется более тщательно, и не одно, а серия, состоящая из 4 — 6 препаратов при одном уколе, либо полученных при заборе крови, который производится 4 — 6 раз в сутки в течение 2 — 3 дней.

Интенсивность паразитемии определяется знаком «+».

  • 1 (+) обозначает выявление от 1 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 5 — 50 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 2 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 50 — 500 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 3 (+) обозначает выявление от 1 до 10 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 500 — 5000 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 4 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 5000 — 50000 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 5 (+) обозначает выявление более 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует более 50000 плазмодиям в одном мкл крови.

Интенсивность паразитемии можно вычислить по количеству паразитов на 100 эритроцитов в 10 полях зрения, либо по соотношению числа паразитов и лейкоцитов в 1 мкл крови.

По интенсивности паразитемии определяется прогноз при тропической малярии. При других видах заболевания более 2% эритроцитов не поражается.

Формы малярийных плазмодиев в разные фазы развития

В препарате крови «толстая капля» возможно определить плазмодии малярии, находящиеся на разных стадиях развития — трофозоида, кольца, шизонта, морулы, и гаметы.

Рис. 5. Plasmodium ovale имеет округлую форму.

Рис. 6. Молодой трофозоит Plasmodium vivax в эритроците.

Рис. 7. Юные трофозоиды Plasmodium falciparum.

Рис. 8. Кольцевидные трофозоиты Plasmodium vivax.

Рис. 9. Амебовидные шизонты Plasmodium vivax.

Рис. 10. Зрелые шизонты Plasmodium vivax.

Рис. 11. Женские гаметоциты возбудителей тропической малярии.

Рис. 12. Гаметоциты плазмодий тропической малярии имеют полулунную форму, плазмодии других видов заболевания — округлую.

Рис. 13. В процессе роста в цитоплазме паразитов накапливается пигмент. На фото Р. vivax.

Контроль эффективности лечения

При адекватном лечении малярии уровень паразитемии в течение суток снижается на 25% и более, а через 3 суток от начала лечения он должен составлять не более 25% от исходного. В случае обнаружения паразитов на 4-е сутки от начала лечения свидетельствует о развитии лекарственной резистентности возбудителей.

Кратность проведения исследования

При выявлении малярии микроскопическое исследование препаратов крови проводится ежедневно. При тяжелой форме тропической малярии микроскопия проводится 2 раза в день до исчезновения возбудителей в крови и далее еженедельно до 28 дня лечения с целью оценки его эффективности и выявления резистентности к противомалярийным препаратам.

Рис. 14. Эритроциты при инфицировании P. vivax и P. ovale увеличиваются, обесцвечиваются и деформируются, в них появляется токсическая зернистость.

При инфицировании P. malariae и P. falciparum форма и размеры эритроцитов не изменяется. На фото деформированные эритроциты больного малярией (микрофотография в сканирующем микроскопе).

Иммунологические методы диагностики малярии

С помощью серодиагностики малярии возможно выявить в сыворотке крови пациента антитела и растворимые паразитарные антигены. Серологические реакции показаны к применению в случаях появления у больных лихорадки неясного генеза, гепатоспланомегалии, анемии, а также для исследования крови донора — предполагаемого источника инфекции. Серологические реакции применяются при эпидемиологическом наблюдении за лицами, проживающими в неблагополучных по малярии в прошлом территориях.

Чаще всего при диагностике малярии применяется НРИФ — непрямая реакция иммунофлуоресценции. Используются так же ИФА, РИГА и др. Внедряется в практику использование реакции энзим-меченых антител (РЭМА).

В случаях очень низкой паразитемии показано применение ПЦР (полимеразной цепной реакции). Дороговизна и сложность применения данной методики не позволяет широко ее использовать.

Разработаны новые методы диагностики малярии — экспрессного микроскопического анализа препаратов крови с использованием флюоресцирующих красителей, позволяющие в течение двух минут выявить паразитов тропической малярии, количество которых более 60 в 1 мкл гемолизированой крови.

При малярии антитела появляются на 8 — 27 день паразитемии. Первыми появляются антитела IgM, затем — антитела IgG. Антитела после перенесенной малярии и успешного излечения могут длительно сохраняться в крови человека — от 0,5 до 2 и даже 20 лет.

Рис. 15. Чаще всего при диагностике малярии применяется НРИФ — непрямая реакция иммунофлуоресценции.

Дифференциальная диагностика малярии

Малярию следует отличать от гриппа и других ОРВИ, кишечных инфекций, лептоспироза, желтой лихорадки, злокачественных форм вирусных гепатитов, тифо-паратифозных заболеваний, сепсиса, бруцеллеза, сепсиса, геморрагических лихорадок, заболеваний крови.

При коматозном состоянии малярию следует отличать от эпидемического цереброспинального менингита, уремической, печеночной и диабетической комы.

Иногда малярию следует дифференцировать с холециститом, холангитом, абсцессом печени, пиелонефритом и лимфогранулематозом.

Рис. 16. Рутинное исследование препарата «толстая капля» в регионах эндемичных по малярии.

Самое популярное Предыдущая статья: Разработан новый препарат от малярии Следующая статья: Как лечить малярию

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКИ МАЛЯРИИ.

Малярия — группа трансмиссивных инфекционных заболеваний, передаваемых человеку при укусах комаров рода Anopheles.

Предварительный диагноз малярии устанавливают на основании клинико- эпидемиологических данных, подтверждается он обнаружением плазмодиев малярии в крови. В эндемических очагах наблюдается тенденция к гипердиагностике малярии, что, однако, гораздо менее опасно, чем гиподиагностика вне эндемических очагов при завозе малярии.

Определенную помощь в диагностике могут оказать результаты общего анализа крови. В результате массового распада эритроцитов у больного малярией возникает гемолитическая анемия, гипербилирубинемия, в связи с чем кожа и слизистые оболочки больного приобретают желтушную окраску. Однако в первые дни болезни она может отсутствовать, даже в первую неделю обычно не выражена, так как потеря какой-то части эритроцитов вследствие гемолиза компенсируется выбросом крови из депо организма.

В результате активизации эритропоэза повышается число ретикулоцитов, возникает полихроматофилия.

Со стороны белой крови для малярии характерны лейкопения, нейтропения, эозинопения, относительный лимфоцитоз. В затянувшихся случаях моноцитоз. Высокий лейкоцитоз при малярии встречается очень редко, в основном при злокачественном течении тропической малярии. Поэтому при наличии лейкоцитоза вообще правильнее думать о другой болезни, а не о малярии, кроме пернициозных её форм.

Характерные для малярии высокие показатели СОЭ так же, как и анемия, выявляются при значительной длительности болезни. В ранние сроки СОЭ может оставаться в пределах нормы, что не должно дезориентировать врача.

В практической работе при исследовании крови на наличие малярийных плазмодиев пользуются, в основном, методом толстой капли. Преимущество этого метода заключается в том, что для приготовления толстой капли используется в 30—50 раз больше крови, чем для тонкого мазка, и поэтому концентрация паразитов в одном поле зрения толстой капли в десятки раз больше, чем в мазке. Следовательно, обнаружить паразитов в толстой капле значительно легче, чем в мазке, что особенно важно при скудной паразитемии. Толстые капли окрашивают без предварительной фиксации, поэтому эритроциты при промывании водой выщелачиваются и паразиты деформируются, в связи, с чем установить вид паразита иногда трудно. В таких случаях требуется дополнительное исследование мазка, который фиксируют перед окраской. В нем хорошо видны детали морфологии паразита и изменения пораженных эритроцитов. Для паразитологического подтверждения диагноза малярии необходимо обнаружение бесполых стадий развития паразита, т.е. трофозоитов и шизонтов.

Паразиты обнаруживаются в крови, как на высоте приступов болезни, так и в промежутках между ними.

Серологическая диагностика малярии. Малярийные антитела появляются в крови после 2-3-го приступа, достигают максимального уровня на 4-6 неделе, затем при отсутствии реинфекции титр их постепенно снижается, сохраняясь на низком уровне в течение 6 мес. и более. Выявляют их с помощью реакции непрямой флюоресценции, РНГА, реакции энзиммеченных антител. Для постановки РНИФ необходимы специфические антигены, в качестве которых используются толстые капли инфицированной крови, содержащей паразитов малярии человека или обезьян, которые по антигенной структуре близки паразитам человека, и сыворотки против IgG человека, меченные изотиоцианатом флюоресцеина. Нижний порог специфической для малярии реакции равен, по данным разных авторов, 1:20, 1:80, 1:160.

Результаты РНГА считаются положительными в разведении 1:40 и выше. При сравнительном изучении установлено, что РНГА уступает РНИФ в чувствительности и специфичности в ранние сроки — первые 2 недели болезни.

В последние годы для диагностики паразитарных болезней, в том числе малярии, используют новый перспективный серологический тест — РЭМА. Основу метода составляет использование антигенов или антител меченных ферментами. Для диагностики малярии в РЭМА используется растворимый антиген из эритроцитарных паразитов. РЭМА отличается высокой чувствительностью и точностью учета результатов с помощью инструментальных методов — на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре. Большинство серологических методов диагностики малярии (пассивная гемагглютинация, преципитация в геле, связывание комплемента и др.) не получили широкого распространения вследствие сложной методики их постановки, необходимости специальной подготовки персонала, наличия особого лабораторного оснащения и стандартизированных антигенов, а также из-за недостаточной специфичности результатов. Даже наилучший из этих методов — метод непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), играет в лабораторной диагностике малярии лишь второстепенную роль.

Во всех случаях диагностики малярии основной является паразитологическая диагностика путем приготовления и изучения препаратов толстой капли и тонкого мазка.

About the author

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *